La acción se abre en las cercanías de Florencia, durante una jornada de caza en el monte, cuando el duque Alberto confía a su gracioso Carlos, llamado también Yepes, una misión secreta. Alberto ama a su prima, la condesa Claudía de Belflor, pero sospecha que ella rehúye verlo por alguna inclinación amorosa oculta; por eso le envía una carta y proyecta entrar después en su quinta disfrazado para observarla de cerca. Claudía, entretanto, vive retirada con su hermana Laura y manifiesta su descontento porque, huérfana y noble, depende del duque para decidir su matrimonio. Aunque niega haber amado a Alberto, teme que una visita suya pueda dar pie a murmuraciones y, al mismo tiempo, deja ver su disgusto por el poder que él ejerce sobre su destino. La llegada de Carlos como falso embajador provoca una extensa escena cómica, pero la situación cambia cuando un caballero perseguido irrumpe en la casa y Claudía ordena protegerlo. El desconocido se presenta como don Juan Manrique, español de Sevilla, y cuenta que, tras amar a una dama prometida que lo despreciaba, mató en Florencia a Camilo Esforcia, hombre poderoso que había deshonrado a aquella mujer y causado su muerte. Conmovida por su relato y por su valentía, Claudía le concede amparo y lo toma a su servicio, sin saber que este don Juan es en realidad el propio duque Alberto disfrazado. Desde ese puesto, Alberto puede observar mejor a la condesa y comprobar, al leer con ella la carta que él mismo le había enviado, que su situación afectiva y política es más compleja de lo que sospechaba.
En la segunda jornada se intensifica el conflicto sentimental. Claudía, ya enamorada de don Juan aunque intenta resistirse, alterna muestras de favor con bruscos desdenes, consciente de la desigualdad social que, según cree, la separa de un simple caballero refugiado y de la obligación de aceptar el marido que su tutor le imponga. Cuando manda a don Juan leer y comentar la carta del duque, él advierte que el escrito encubre interés amoroso; ella, sin embargo, teme que se burlen de su persona y de sus desprecios. Más tarde, en una larga confidencia, Claudía explica a don Juan que Alberto es su primo y tutor, que se rumorea su boda con una princesa de Hungría y que precisamente por sentirse desdeñada decidió no dejarse ver de él. Al mismo tiempo confiesa, sin nombrarlo del todo, que la atormenta una nueva pasión que juzga impropia por la diferencia de estado. Mientras Alberto entiende así que la condesa lo ama a él mismo sin reconocerlo, decide valerse también de Laura para probar los celos de Claudía y fingir un interés amoroso hacia la hermana. Paralelamente aparece en la quinta otro pretendiente, el duque de Ferrara, Federico, que también se introduce de forma encubierta bajo el nombre de Fabio y como supuesto criado de Carlos. La superposición de disfraces y cartas provoca nuevas confusiones: una carta y un diamante de Federico llegan a manos de don Juan, Claudía se los quita creyendo descubrir una traición o un comercio amoroso oculto, y su reacción violenta delata unos celos que no puede seguir encubriendo. Aunque procura desembarazarse de don Juan enviándolo de vuelta a España, cada vez resulta más claro que el amor contradice los desdenes con que pretende defender su honor y su autoridad.
En la tercera jornada los equívocos alcanzan su máxima tensión y se encaminan al desenlace. Claudía reconoce ante Laura que su pasión por don Juan ya es casi pública y decide castigarlo para contenerse, pero sus mismas acciones revelan lo contrario. Carlos es llevado ante ella y, a través de sus palabras y de la presencia de Fabio, se descubre que el supuesto criado es en realidad Federico, duque de Ferrara, mientras don Juan sigue creyendo que Claudía favorece a ese rival. Herido por los celos, Alberto se encara con la condesa y le reprocha sus aparentes mudanzas; ella, oscilando entre el rigor y el afecto, llega incluso a ordenar que lo persigan y le den muerte, aunque inmediatamente trata de salvarlo mediante una carta en que le confiesa por fin que lo ha querido y le pide que huya antes de la llegada del duque de Florencia. Cuando Alberto recibe esa declaración, su esperanza se confirma, pero en ese momento comparecen también Federico y el propio Alberto, ya descubierto como duque de Florencia, y ambos exponen sus pretensiones ante la condesa. Alberto justifica sus engaños alegando que quiso comprobar por sí mismo la voluntad de Claudía y no perjudicar a Federico; este se considera ofendido por la competencia desleal, pero acepta que la elección sea de la dama. Claudía entonces pronuncia la sentencia final: da a Laura por esposa al duque de Ferrara y se casa ella misma con el duque de Florencia, es decir, con Alberto, reconociendo así el amor que sus desdenes habían ocultado. Carlos, recompensado con doce mil ducados, cierra festivamente la acción, y el título de la comedia queda explicado porque los desprecios de Claudía no eran negación del amor, sino su máscara conflictiva.