La acción se inicia de noche en Lorena, adonde llega Don Alonso de Ayala acompañado de su criado Cobertera después de haber servido en Creta y de haber recibido de su tío Don Bermudo de Contreras el retrato de una supuesta prima llamada Rosimunda, con la que piensa casarse. Mientras esperan el amanecer para localizar la casa de Don Bermudo, Don Alonso relata sus hazañas militares y cómo salvó en Creta a una dama llamada Lucelinda. Poco después oye las quejas de una mujer encerrada bajo una losa, desciende a una gruta o cisterna y encuentra allí a una mujer vestida con pieles que afirma llamarse Rosimunda. Ella le cuenta una historia dolorosa: tras la muerte de su esposo, el hermano de este, enamorado de ella, la encerró durante años en aquel encierro subterráneo fingiendo en Lorena que había muerto. Don Alonso, movido por la compasión y por la coincidencia con el retrato recibido, promete liberarla en la noche siguiente, sin saber que esa mujer es en realidad su propia madre. Al amanecer llega a la casa de Don Bermudo, donde encuentra a Irene y descubre que el retrato que lo movió a venir había sido cambiado por el enamorado Celio para favorecer sus propios intereses. Don Bermudo mantiene además a la mujer encerrada en condición degradante, haciéndola salir a comer los huesos sobrantes, y Don Alonso, cada vez más impresionado por su parecido con la imagen del retrato y por su sufrimiento, queda ligado a ella por compasión, deseo y error de identidad.
En la segunda jornada se multiplican los engaños. Irene, celosa del interés de Don Alonso por la cautiva, decide abrir la gruta y cambiar sus vestidos con los de la presa para ocupar su lugar; así espera atraer a Don Alonso y apartar a su rival. Don Alonso, fiel a su promesa, baja a sacar a la mujer que cree Rosimunda, pero en realidad rescata a Irene disfrazada, mientras la verdadera permanece oculta en la gruta. Don Bermudo, que vigila y sospecha, llega a intentar matar a la mujer que cree Rosimunda sin reconocer al principio que es su propia hija Irene; la oscuridad, los disfraces y los rostros semejantes alimentan la confusión. A ello se suma la aparición de un falso Don Alonso, Celio, que se ha fingido sobrino de Don Bermudo para acercarse a Irene, provocando un duelo entre ambos pretendientes. Mientras tanto, el verdadero Don Alonso vuelve a la gruta, halla a la auténtica Rosimunda y acuerda con ella una nueva fuga nocturna. Más tarde, por las canciones convenidas como seña, Don Alonso encuentra de nuevo a la mujer equivocada y sale con Irene creyendo que lleva consigo a Rosimunda; la obra explota así de manera continua el equívoco entre madre, hija y retrato, así como la ceguera de los personajes ante su verdadero parentesco.
La tercera jornada desplaza la acción a una quinta o casa de campo. Allí Don Alonso y la mujer a la que acompaña acaban descubriendo, por la presencia simultánea de Rosimunda y de otros personajes, que sus afectos se han dirigido hacia personas distintas de las que creían. Don Bermudo persigue a Rosimunda y a Irene con violencia, intenta vengar lo que considera deshonra y deja a ambas atadas en el bosque para que mueran, mientras el anciano hortelano de la quinta, que en realidad es Clodobeo, antiguo esposo de Rosimunda dado por muerto, las socorre. A través de un largo relato se aclara la historia oculta: Clodobeo no había muerto, sino que fue atacado, dado por enterrado y llevado después a cautiverio en Constantinopla, donde tuvo un hijo llamado Alejandro antes de regresar a Lorena como hortelano al servicio de Don Bermudo. El joven Alejandro resulta ser el mismo Don Alonso, criado sin conocer su origen, de modo que Rosimunda es su madre y el amor nacido del retrato queda revelado como un amor incestuoso debido al error. Reunida la familia, también se reconoce a Clodobeo como esposo legítimo de Rosimunda y padre de Don Alonso/Alejandro. Finalmente todos se disponen a matar a Don Bermudo por sus agravios, pero Rosimunda pide clemencia; el perdón se impone, Celio queda señalado como el principal culpable de la deshonra de Irene, y Don Alonso acepta dar la mano a su prima Irene, con lo que se restablecen los vínculos legítimos tras el cúmulo de engaños, cautiverios y reconocimientos.