La acción comienza entre los festejos cortesanos que acompañan en Portugal las bodas políticas de las infantas Isabel y Leonor con los monarcas de Castilla y del Imperio. En ese ambiente aparece don Juan de Meneses consumido por un amor antiguo hacia la infanta doña Leonor, con quien se ha criado desde niño. Confiesa a su amigo el conde de Arroyolos que ese afecto, nacido en la infancia, se ha vuelto pasión imposible por la desigualdad de estado, y que la partida de Leonor a Alemania lo desespera. Sin embargo, la propia Leonor, al despedirse, le ordena que la acompañe como gentilhombre, lo que reanima sus esperanzas. Paralelamente, la obra traslada la atención a Castilla y al matrimonio de Juan II con Isabel de Portugal, gestionado por don Álvaro de Luna. En Badajoz y luego en la entrada de la reina en Castilla se produce un equívoco decisivo: don Pedro Girón muestra al rey un retrato que cree de la futura reina y que en realidad corresponde a doña Beatriz de Silva, dama portuguesa de extraordinaria hermosura. Juan II queda súbitamente prendado de esa imagen y, aun después de advertir el error, dirige su atención hacia Beatriz, mientras la propia reina Isabel procura disimular el desaire y contener la situación.
Ya en Tordesillas, durante las fiestas de la corte castellana, doña Beatriz se convierte en centro de admiración general. Varios caballeros nobles la pretenden, entre ellos don Pedro Pereira, don Diego Sarmiento, don Luis de Velasco y don Pedro Girón, y ella, con liberalidad cortesana, reparte favores sin comprometerse abiertamente con ninguno. Esa conducta, que en el texto aparece como afabilidad y gusto por agradar, suscita celos cruzados entre los pretendientes y, sobre todo, en la reina Isabel. La situación se agrava cuando Juan II, ya enamorado de Beatriz, le envía por mediación de doña Inés un billete amoroso en el que lamenta no poder hacerla reina de Castilla y le ofrece al menos el señorío de su voluntad. Isabel intercepta la carta y, en un acceso de celos, acusa a su prima de liviandad, interpreta como pruebas de culpa los guantes, la flor y el mondadientes que Beatriz había dado a diversos caballeros, y termina encerrándola secretamente en un armario o aposento sin alimento, con intención de apartarla del rey e incluso de dejarla morir. Mientras tanto, la ausencia de Beatriz provoca alboroto en la corte, divide a los galanes en bandos y despierta sospechas contra la reina. En una línea paralela, don Juan de Meneses acompaña a Leonor a Roma, persiste imprudentemente en su amor y recibe de ella una bofetada humillante cuando intenta interpretar su trato como señal amorosa; el golpe lo desengaña, lo mueve a abandonar la vanidad mundana y lo encamina hacia la vida religiosa bajo el nombre de fray Amador.
La tercera jornada resuelve los conflictos cortesanos y transforma la historia en relato hagiográfico. Encerrada y casi muerta, doña Beatriz recibe la visita sobrenatural de una niña resplandeciente vestida de blanco y azul, que se identifica como la Virgen María concebida sin mancha y le anuncia su destino: abandonar la corte, hacerse religiosa y fundar en Toledo una orden dedicada a la defensa de la Pura Concepción. También le revela la conversión de su hermano, el antiguo don Juan de Meneses, y la futura expansión de esa devoción. Poco después, descubierta la prisión, Beatriz sale viva por amparo divino ante el rey, la reina y los caballeros; lejos de acusar con violencia a Isabel, responde con humildad. Cuando el peligro persiste, decide retirarse por su cuenta al monasterio de Santo Domingo el Real de Toledo, dejando una carta en la que explica que huye de los riesgos palaciegos. Disfrazada de labradora y acompañada por Melgar, emprende la fuga; en el camino recibe nuevas confirmaciones sobrenaturales, probablemente de san Francisco y san Antonio, sobre la fundación futura y la importancia histórica de la defensa inmaculista. Finalmente, el rey y la reina la alcanzan cerca de Toledo, aprueban su decisión y la acompañan con respeto a su nuevo estado. Isabel depone sus celos, reconoce la excelencia de su prima, y la obra concluye con la entrada de Beatriz en la vida religiosa y con el anuncio de una segunda parte dedicada a la fundación, milagros y muerte de la protagonista.