La obra presenta desde el comienzo un conflicto de dimensión religiosa y política: fuerzas infernales, asociadas a Luzbel y a Lutero, amenazan a la Iglesia y a la autoridad pontificia, mientras se anuncia que Dios levantará defensores contra la herejía. En ese marco aparecen dos figuras llamadas Carlos: el emperador Carlos V, protector temporal de la fe, y Carlos Borromeo, destinado a ser sostén espiritual de la Iglesia. Un sueño profético del papa Pío IV le persuade de apartar a su sobrino Carlos Borromeo de un matrimonio ya concertado con la marquesa Firmia Farnesio y de llamarlo al estado eclesiástico, dispensándole la edad para ordenarse y nombrándolo además arzobispo de Milán. En Milán, sin embargo, todo parecía preparado para las bodas entre Carlos y Firmia. Ambos se conocen y se tratan con cortesía y admiración, pero en torno a ese enlace surge un foco de violencia: el duque Esforcia, pariente de Firmia y enamorado de ella, decide impedir la boda y, aconsejado por sus criados, intenta matar a Carlos mediante un papel envenenado fingidamente enviado por la marquesa. Carlos, antes de leerlo, rompe el billete, frustrando el crimen. Poco después recibe la carta pontificia que le manda aceptar el capelo cardenalicio, ordenarse y abandonar el matrimonio para consagrarse a la Iglesia, disponiendo que Firmia case con Federico, hermano de Carlos. La noticia desencadena la desesperación de Firmia, que se siente burlada y traicionada, mientras Carlos obedece con firmeza al mandato papal y se marcha dejando a la dama entregada al rencor.
Ya en la segunda jornada, Carlos aparece convertido en arzobispo y cardenal ejemplar de Milán, retirado por momentos en una casa de recreo para escribir contra Lutero y promover la convocatoria del concilio de Trento. El texto insiste en su santidad, en su rigor reformador y en su prestigio público, aunque precisamente esas mismas cualidades suscitan enemigos. Firmia, incapaz de aceptar la pérdida de Carlos, idea un atrevido engaño: disfrazarse de joven cardenal, imitando probablemente al cardenal Farnesio, para entrar en la intimidad de Carlos y declarar su pasión. A solas, le refiere un relato engañoso sobre una supuesta visita a Firmia que habría turbado su pureza, pero termina revelando su identidad e intentando forzar una unión clandestina. Carlos rechaza con energía la trampa y huye, y Firmia, despechada, llega a arrojarse a un estanque en una escena extremada que no logra conmoverle hacia el amor, aunque sí provoca confusión entre los presentes. Paralelamente se desarrolla otro frente de conflicto: fray Jerónimo, vinculado a la orden de los Humillados, acusa a Carlos de perseguir y reformar con exceso a su religión, y encuentra en el duque Esforcia un aliado ocasional, pues ambos desean destruir al prelado. Firmia y el duque, ya unidos por el agravio común, convierten una supuesta ofensa contra su honor en motivo de venganza y organizan emboscadas con bandidos y disfraces. En una de ellas capturan por error a Fripolín, criado de Carlos, vestido con atuendo ajeno, mientras el propio Carlos logra escapar de diversos peligros, incluso de un alojamiento fronterizo dominado por luteranos o simpatizantes de Lutero, donde defiende verbalmente la verdad de Roma y sale milagrosamente libre cuando la violencia amenaza su vida.
La tercera jornada traslada la acción a un Milán asolado por la peste y el hambre, circunstancia en la que Carlos alcanza su máxima grandeza dramática. Se le muestra dedicado por entero al socorro de los pobres y enfermos: carga personalmente a los apestados, lleva el Santísimo, reparte pan por millares y consume su casa y sus bienes en obras de caridad. Incluso sus adversarios quedan atónitos ante esa conducta, aunque algunos, como el duque de Alburquerque, recelan de su autoridad y de sus conflictos jurisdiccionales con el poder civil. Mientras tanto, Firmia y Hortensio traman un nuevo asesinato por veneno, pero dos niños pobres, agradecidos por el pan recibido, revelan la conspiración. Carlos desenmascara a los culpables sin perder la misericordia: obliga a Firmia a probar la copa para mostrarle que no le ha dado veneno, y en esa escena se manifiesta también el demonio, que reconoce haber alimentado la pasión desordenada de la marquesa y anuncia la futura lucha doctrinal en Trento. Firmia, ya desengañada, pone su honra en manos de Carlos y termina reconciliada, encaminándose hacia el matrimonio con Federico. Todavía persiste la violencia de fray Jerónimo, que dispara contra Carlos en su oratorio, pero la bala no le hiere y queda aplastada en el roquete, prodigio que confirma la protección divina; aun así, Carlos perdona al agresor y lo deja libre, prefiriendo vencer por clemencia. Después recibe una visión gloriosa en la que un serafín purifica sus labios y contempla simbólicamente las dos columnas de Carlos: una ligada al pontífice y a su propia misión eclesiástica, otra a la defensa imperial de la fe frente a Sajonia y Lutero. La obra concluye con la llegada de Federico y Firmia como novios ya restituidos al orden social, con la reconciliación del duque Esforcia y con la partida de Carlos a Trento, donde espera combatir el luteranismo y consolidar, como una de las dos columnas de la cristiandad, la defensa católica.